Контрольная работа: Дифтерия 2

План работы:

1. Краткая характеристика инфекций, основные системы.
2. Характеристика возбудителя:
2.1. Морфологические и тинкториальные свойства;
2.2. Культуральные свойства;
2.3. Биохимические свойства;
2.4. Токсические свойства;
2.5. Антигенные свойства;
2.6. Резистентность;
2.7. Патогенность для животных;
3. Патогенез и эпидемиология.
4. Иммунитет.
5. Лабораторная диагностика.
6. Специфическая профилактика и терапия.

1. Краткая характеристика инфекций, основные системы.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание, вызываемое Corynebacterium diphtheriae и ее токсином. Бактерии вызывают воспаление воздухоносных путей, реже кожных покровов. Токсин приводит к дегенерации периферических нервов, сердечной мышцы и других тканей. Заболевание известно очень давно; еще сирийский врач историограф Аретей Каппадокийский (1 век до н.э.) охарактеризовал его как «злокачественные язвы на миндалинах, ведущие к удушению». Последнее настолько характерно, что в Испании дифтерию называли «гаратилью», то есть маленькая гаррота (устройство, применяемое для удушения преступников). Возбудитель – Corynebacterium diphtheriae; впервые его выделил Э.Клебс (1883), а чистую культуру возбудителя получил Ф.Лёффлер (1884).

2. Характеристика возбудителя.

2.1. Морфологические и тинкториальные свойства.

Дифтерийная палочка (палочка Клебса – Леффлера) представлена тонкими, слегка изогнутыми или прямыми палочками размером 1 – 12 × 0,3 – 0,8 мкм. Часто они утолщены на концах и напоминают булаву. Для дифтерийной палочки характерен выраженный полиморфизм. Наряду с типичными формами, можно обнаружить карликовые, кокковидные, толстые с колбовидным утолщением на концах, гигантские, клиновидные, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки. У С . Diphtheriae выделяют три биовара – gravis, mitis и intermedius.

· Бактерии биовара gravis – короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.

· Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много волютиновых зерен (тельца Бабеша-Эрнста).

· Бактерии биовара intermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них характерны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов. В настоящее время биовар intermedius относят в группу gravis.

С. diphtheriae хорошо окрашивается основными анилиновыми красителями, грамположительна (окрашивание не всегда равномерно). Для окраски мазков обычно применяют щелочной метиленовый синий по Леффлеру либо окрашивают их по Найссеру. Бактерии способны образовывать L- и фильтрующиеся формы. В мазках С. diphtheriae располагаются в виде «растопыренных пальцев», «иероглифов», «паркета», латинских букв V, Y, L и т.д.

2.2. Культуральные свойства.

Дифтерийная палочка хорошо растет при 36-37ºС; оптимум рН 7,4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са2+ , Mg2+ , Fe2+ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Леффлера) дают рост уже через 10-12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. На таких средах возбудитель образует серовато-черные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирующегося внутри бактерий. В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.

2.3. Биохимические свойства.

С. diphtheriae сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, манит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференцировки. Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать палочку сахарозу и разлагать мочевину – дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак – способность разлагать цистин. С. diphtheriae продуцирует каталозу, гиалуронидазу, нейромидазу, ДНК-азу и др. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика. Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину.

Бактериоцины. Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицины), образующие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины образуют как токсические, так и нетоксические штаммы.

2.4. Токсические свойства.

С. diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин – основной фактор патогенности. Нетоксигенные штаммы не вызывают развития заболевания . В чистом виде токсин впервые получили Э.Ру и А.Иерсен (1888), что явилось решающим моментом для установления этиологической роли микроорганизма. Токсин проявляет все свойства экзотоксина (термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой). Нативный токсин – полипептид с Мr около 72000; его образуют фрагменты А (проявляет ферментативную активность) и В (взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновения фрагмента А). клетки всех чувствительных организмов способны рецептировать В – фрагмент и поглощать молекулу посредством эндоцитоза. В кислой среде эндосом (фаголизосом) дисульфидные связи, объединяющие оба компонента, разрушаются фрагмент В взаимодействует с мембраной эндосомы, облегчая проникновение фрагмента А в цитоплазму. Последний устойчив к денатурации и длительно сохраняется в цитозоле. Механизм цитотоксического действия связан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Подобным свойством обладают многие токсины, но лишь дифтерийный токсин и токсин А Pseudomonas aeruginosa имеют специфическую мишень – фактор элонгации 2 – трансферазу, ответственную за наращивание (элонгацию) полипептидной цепи на рибосоме.

Дифтерийный токсин катализирует перенос АТФ-рибозы от цитоплазматического никотинамиддинуклеотида (НАД) к фактору элонгации 2, приводя к АТФ-рибозилированию гистидиновых остатков в молекуле фактора с необратимым блокированием элонгации полипептидной цепи (то есть любого белкового синтеза). Немодифицированный фактор элонгации 2 образует комплекс с ГТФ и тРНК, связывающийся с мРНК в эукариотических клетках, после чего ингибирует белковый синтез, в том числе и в миокарде, приводя к структурным и функциональным нарушениям, способным вызвать смерть больного. Результат действия токсина на нервную ткань – демиелинизация нервных волокон, часто приводящая к параличам и парезам.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterium diphtheriae , инфицированные бактериофагом (β-фаг), несущим ген tox , кодирующий структуру токсина. Образование последнего наиболее выражено при вступлении бактериальной популяции в стадию отмирания. Переход умеренного фага в литическую форму мало влияет на синтез токсина.

Активность токсина. 1 ЕД Dlm дифтерийного токсина равна наименьшей концентрации, убивающей морскую свинку массой 250 г на 4-5-е сутки (около 0,25-0,1 мкл). Для получения анатоксина используют штамм PW-8 либо его варианты – «Массачусетс», «Торонто» и др.

2.5. Антигенные свойства.

У С. diphtheriae выделяют О- и К-Аг. Липидные и полисахаридные термолабильные фракции О-АГ коринебактерий преимущественно представлены межвидовыми Аг. Поверхностные термолабильные К-Аг (нуклеопротеиды, белки) обеспечивают видовую специфичность и проявляют выраженную иммуногенность. С помощью анти-К-сывороток дифтерийные бактерии разделяют на серологические варианты. Биовар mitis включает 40 сероваров, gravis – 14, intermedius – 4. в отечественной практике используют диагностические агглютинирующие, неадсорбированные сыворотки; в том числе полигрупповые и к сероварам для РА на стекле и в пробирках.

2.6. Резистентность.

Коринебактерии дифтерии устойчивы к факторам окружающей среды, высыханию и могут долго сохранять жизнеспособность, например, на мягких игрушках — до 3 мес. Дезинфицирующие вещества (5% раствор карболовой кислоты, 1% раствор сулемы и др.) Дифтерийные бактерии чувствительны к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и другим антибиотикам.

2.7. Патогенность для животных.

К дифтерийному экзотоксину чувствительны морские свинки. Токсигенность коринебактерии определяется внутрикожным методом, позволяющим на одной морской свинке изучить токсигенность нескольких штаммов. При подкожном введении дифтерийных бактерий свинка погибает на 2—5-й день. На вскрытии обнаруживаются резкое увеличение и гиперемия надпочечников — специфическое действие экзотоксина.

3. Патогенез и эпидемиология.

Входные ворота для возбудителя – слизистые оболочки носоглотки, иногда глаз, половых органов (у женщин), поврежденные кожные покровы. Дифтерийная палочка колонизирует ткани в месте внедрения, вызывая развитие местного фибринозного воспаления. При этом тип воспаления зависит от строения слизистых оболочек. Например, в однослойном цилиндрическом эпителии дыхательных путей формируется крупозное воспаление, на многослойном плоском эпителии образуется желто-серая фибринозная пленка, плотно спаянная с прилежащими тканями. Подобный тип поражений известен как дифтеритическое воспаление. Разрастание пленок и переход процесса, поражающего нервную систему (преимущественно периферические симпатические узлы), сердце и сосуды, надпочечники и почки. Ферменты С. diphtheriae (гиалуронидаза, нейромидаза, фибринолизин) обеспечивают проникновение возбудителя в различные ткани, включая кровоток. Однако (в отличии от токсинемии) бактериемия клинически не проявляется.

Резервуар дифтерии — человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15-20 сут. Основной путь передачи дифтерийной палочки — воздушно-капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко). При комнатной температуре во влажной атмосфере палочка Клебса-Лёффлера сохраняется долго. При 60°С дифтерийная палочка отмирает в течение 10 мин; в высушенных плёнках выдерживает температуру 98 "С в течение 1 ч, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 мес. На игрушках дифтерийная палочка сохраняется до 2 нед, в пыли — до 5 нед, в воде и молоке — до 6-20 сут, на рассеянном свету остаётся жизнеспособным до 8 ч. Дезинфектанты и антисептики инактивируют возбудителя дифтерии в течение 5-10 мин. Пик заболеваемости дифтерией приходится на осенне-зимние месяцы.

4. Иммунитет.

После заболевания длительное время сохраняется антимикробный и антитоксический иммунитет. Грудные дети дифтерией не болеют, так как у них имеется пассивный иммунитет от матери. Наиболее восприимчивы дети в возрасте от 1 года до 5—6 лет. Для выявления антитоксического противодифтерийного иммунитета используется внутрикожная проба Шика. У детей, восприимчивых к дифтерии, на предплечье в месте введения малых доз дифтерийного токсина через 48 ч появляются покраснение и инфильтрат, что свидетельствует об отсутствии антитоксинов в крови.

5. Лабораторная диагностика.

С целью раннего выявления заболевания и определения носителей необходимы выделение и идентификация возбудителя, а так же определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтерические пленки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов. Забор материала проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через три часа.

Бактериоскопия. Окраска по Граму не является специфичной, так как бактерии сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде полисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выделить характерные зерна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки. C . pseudodiphtheriticum (С. hofmannii ), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование. Бактерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга ΙΙ или Маклеода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофмана) теллур не восстанавливает . Для выделения чистой культуры часть подозрительной колонии засевают на скошенный сывороточный агар, вторую часть – на твердую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности ( проба Пизу). При положителном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хисса, пользуясь укороченным «пестрым» рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатогенных коринебактерий. Для идентификации биоваров используют «длинный» ряд углеводов включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растет только С. diphtheriae ) .

Определение токсикогенности.

Определение in vivo . Проводят подкожным и внутрикожным заражением 0,5 – 1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 часа до заражения одному животному вводят дифтерийный антитоксин. При положительном результате не иммунизированные животные погибают в течение 3 -5 суток.

Определение in vitro . Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатитеского эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пироксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК – зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека . На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетоксигенного штаммов параллельными штрихами. На вырасшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и вместе встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или «стрелы». На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (0,25 МЕ), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная структура также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.

Фаготипирование. Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 коринефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis .

6. Специфическая профилактика и терапия.

Первоначально развитие заболевание предупреждали введением инактивированного антисывороткой дифтерийного токсина. В настоящее время основу профилактики дифтерии составляет плановая или постэкспозиционная вакцинация. Для иммунопрофилактики применяют дифтерийный анатоксин, разработанный Г.Рамоном. Препарат – токсин, лишенный ядовитых свойств обработкой 0,4% раствором формалина и выдержкой в термостате при температуре 40ºС в течение 30 суток, но сохранивший иммуногенность. Очищенный и концентрированный препарат входи в состав комбинированных вакцин – АКДС, АДС, АДС – М.

· Наличие и содержание АТ к дифтерийному токсину определяют в РПГА и РНГА.

· Постинфекционный иммунитет нестойкий, поэтому реконвалесценты подлежат вакцинации в общем порядке.

· При выявлении заболевания в детских коллективах контактировавших с заболевшими детьми лиц следует обследовать бактериологическим и изолировать от коллектива на 7 суток.

Поскольку патогенез поражений обусловлен действием токсина, то основу специфической терапии составляет противодифтерийная лошадиная сыворотка (антитоксин), содержащая не менее 2000 международных антитоксических единиц активности (МЕ) 1мл. антитоксин вводят внутримышечно или внутривенно в дозах, соответствующих тяжести заболевания (от 20000 до 100000 ЕД). открытие Э.Беренгом и Ш.Китазато антитоксических свойств сыворотки иммунных животных явилось одним из важных этапов развития микробиологии, а практическая медицина получила возможность противостоять этой высоколетальной инфекции. Параллельно назначают эффективные антимикробные препараты (амигликозиды, цефалоспорины), а также проводят симптоматическую терапию. Выписку больных проводят только после двукратного отрицательного результата бактериологического обследования.

Дифтероиды.

По морфологическим и культуральным свойствам с возбудителями дифтерии сходна большая группа бактерий рода Corynebacterium, обозначаемых как кориноформные бактерии, или дифтероиды. Они широко распространены в окружающей среде – в воздухе, почве, пыли, воде, а также в некоторых пищевых продуктах (например, молоке). Нередко их выделяют от клинически здоровых лиц, а также при различных заболеваниях (часто их роль остается неясной). От человека их наиболее часто выделяют со слизистой оболочки носоглотки (где они доминируют наравне со стафилококками), с эпителия влагалища (особенно у детей), а также из различных ран. Большинство видов представлено организмами-комменсалами, например C . pseudodiphtheriticum (палочка Хофмана) и С. xerosis , но также имеются виды, вызывающие спорадические поражения человека (C . ulceras , C . jeikeium , C . urealyticum , C . minutissimum и др).

Литература:

1. «Медицинская микробиология, вирусология и иммунология». Под редакцией академика РАМН А.А. Воробьева, Москва – 2008г.

2. «Медицинская микробиология» Главные редакторы академик РАМН В.И. Покровский, профессор О.К. Поздеев. Москва – 1998 г.

3. «Медицинская микробиология» Под редакцией академика РАМН В.И. Покровского. Москва – 2006г.