Лабораторная работа: Осаждение частиц

Реферат на тему:

Осаждение частиц

2009

Скорость осаждения частиц

Под словом «частица» условимся подразумевать (если об этом пойдет речь) и крупные макромолекулы белков или нуклеиновых кислот.

1. При одинаковых плотностях частицы большего размера оседают намного быстрее, чем мелкие .

2. Скорость оседания («седиментации») увеличивается с увеличением плотности частиц. Особенно сильно это проявляется в условиях, когда плотность среды близка к плотности частицы. Возможна ситуация, когда мелкие, но более плотные частицы будут оседать быстрее, чем крупные.

3. Скорость оседания частиц пропорциональная квадрату числа оборотов ротора в минуту.

4. Чем больше вязкость среды, тем медленнее оседание частиц.

5. Скорость седиментации пропорциональна расстоянию частицы от оси вращения ротора. Это расстояние увеличивается по мере продвижения частицы вдоль оси пробирки, поэтому при постоянстве прочих условий скорость седиментации должна непрерывно (хотя и медленно) возрастать. Если это нежелательно, то следует повышать плотность или вязкость среды в радиальном направлении так, чтобы они компенсировали увеличение радиуса вращения.

Имеет смысл ввести понятие «плавучей плотности» частиц. Дело в том, что проявляющая себя при ультрацентрифугировании плотность частицы обусловлена не только ее химическим составом и пространственной структурой. К примеру, она сильно зависит от степени «гидратации» частицы — количества прочно связанной с ней воды. Эта вода движется вместе с частицей, значительно уменьшая ее эффективную плотность. Количество этой воды заметно уменьшается в присутствии высоких концентраций ионов или иных гидрофильных молекул, тоже связывающих воду (свободной воды не хватает!). С другой стороны, некоторые ионы или молекулы могут сами прочно связываться с частицами, увеличивая их эффективную плотность.

Поэтому для данного типа частиц, оседающих в данной среде, вводят понятие «плавучей плотности». Ее можно определить экспериментально, измерив плотность среды в точке, где движение частицы прекращается ввиду равенства нулю скобки в формуле 1 (см. ниже — «равновесное ультрацентрифугирование»).

Наконец, отклонение формы частицы от сферической тоже сказывается (не очень сильно) на скорости их оседания. В связи с этим стоит напомнить, что как макромолекулы белков, так и молекулы достаточно высокополимерных нуклеиновых кислот в растворе сворачиваются в хаотические клубки, форма которых близка к сферической.

Раздельное осаждение частиц

Предположим, что из гомогената клеток, уже освобожденного низкоскоростным центрифугированием от ядра, митохондрий и обрывков наружной оболочки, требуется выделить рибосомы, внутренние мембраны и еще более мелкие частицы. Можно так подобрать умеренную скорость вращения углового ротора (при значительном объеме пробирок), что в осадок попадут только самые крупные частицы, даже те из них, которые вначале находились вблизи мениска. Менее крупные частицы при этом почти полностью останутся в надосадочной жидкости (супернатанте), за исключением тех, которые с самого начала уже находились у дна пробирки — они войдут в состав осадка. Для хорошей очистки крупных частиц супернатант осторожно сливают, осадок вновь суспендируют (в буфере) в полном объеме пробирки и снова центрифугируют в тех же условиях. Эту операцию можно повторить 2—3 раза, после чего осадок окажется практически однородным. Здесь есть одно тонкое место, относящееся к суспендированию осадков. Крайне нежелательно образование комков, взвешенных в жидкости. Они могут долгое время не расходиться, удерживая внутри себя менее крупные частицы. Чтобы этого избежать, необходимо каждый раз с минимальным количеством буфера, или вовсе без него, долгое время стеклянной палочкой растирать осадок по окрестным стенкам пробирки. Палочка должна быть не слишком тонкой, — всего в 3-4 раза меньше по диаметру, чем пробирка, — и заканчиваться ровной сферой без каплевидного утолщения. (Искусство экспериментатора в немалой степени состоит в предусмотрительности по отношению к подобным «мелочам».) Осадки могут быть и невидимы, но их все равно надо растирать. Для ориентировки можно предварительно пометить пробирки у верхнего края краской и устанавливать в ротор этой меткой кнаружи.

Первый слитый супернатант можно центрифугировать повторно на большей скорости и точно таким же образом очистить в нем частицы средних размеров. Зетем, если надо, собрать и самые мелкие.

Зонально-скоростное ультрацентрифугирование

Особенности этого типа центрифугирования отражены в самом его названии: «скоростное» — потому что частицы разделяются по скорости их оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды; «зональное» — так как частицы различных размеров оседают более или менее тонкими слоями — «зонами». Осадков не образуется. Центрифугирование ведут в бакет-роторах. После того, как зоны достигнут оптимального распределения по длине пробирки, центрифугирование прекращают, и зоны частиц описанным ниже способом извлекают одну за другой.

Здесь, в отличие от предыдщуего случая, частицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновременно — при одном центрифугировании.

Исходную смесь частиц разных размеров (хотя бы тот же наполовину очищенный гомогенат клеток) наносят тонким слоем на более плотную (чем буфер гомогената) среду, заполняющую пробирку бакет-ротора. В ходе центрифугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются в направлении дна пробирки, в определенной степени сохраняя очертания исходного слоя, где они были распределены. За ними, с отставанияем, но тоже в виде отдельного слоя двигаются менее крупные частицы, затем еще более мелкие и т. д. Так образуются дискретные зоны частиц разных размеров.

Для того, чтобы зоны оставались узкими, необходимо противодействовать конвекции жидкости, в которой движутся частицы. Эффективный способ подавления конвекции — увеличение плотности этой жидкости вдоль радиуса вращения в направлении от мениска ко дну пробирки. Например, можно заполнять пробирку бакет-ротора водным раствором сахарозы, концентрация которой нарастает по направлению ко дну пробирки. А затем уже на этот «градиент сахарозы» (как его для краткости называют) наслаивать препарат — смесь подлежащих разделению частиц.

Кроме того при зонально-скоростном центрифугировании желательно избавиться от упомянутого ранее увеличения скорости движения частиц по мере их продвижения вдоль пробирки. В противном случае может сложиться ситуация, когда ниболее тяжелые частицы достигнут дна пробирки раньше, чем две зоны легких частиц успеют отделиться друг от друга. Как видно из формулы 1, увеличение плотности среды уже частично нейтрализует влияние удаления зоны от мениска. Но не очень эфективно, особенно если плотности частиц значительно больше плотности среды. Куда эффективнее может влиять увеличение вязкости. Поэтому для создания «тормозящего градиента» целесообразно использовать градиент концентрации вещества, которое обладало бы обоими желательными качествами (+химическая нейтральность). Пожалуй, лучше всего этому требованию отвечают растворы сахарозы, как это видно из нижеследующей таблицы, где р выражено в г/см³ , а г — в сантипуазах. Все при температуре +5°С — обычной при обработке биологических препаратов.

На практике, в зависимости от задачи чаще всего используют градиенты сахарозы 5—20% и 15—30%. Устройство для создания линейного градиента концентрации сахарозы аналогично тому для создания градиента пористости ПААГ. Отличие в том, что по причине большой вязкости растворов сахарозы вместо магнитной мешалки используют вращающуюся в стакане смесителя винтообразную полоску, изготовленную из подогретого плексигласа, которая гонит жидкость вверх (рис. ).

Рис.

Материал полиалмерных и поликарбонатных пробирок плохо смачивается водой. Поэтому подавать жидкость в пробирку по стенке неудобно — она будет скатываться каплями, нарушая плавность градиента. Лучше, как это показано на рисунке, подавать раствор сахарозы через длинную иглу на дно пробирки. В смеситель в этом случае заливают раствор сахарозы минимальной концентрации, а в резервуар — максимальной. Более плотный раствор сахарозы будет плавно оттеснять кверху менее плотные слои.

В некоторых случаях, например, когда желательно, чтобы крупные частицы, приближаясь ко дну пробирки, не только не увеличивали бы скорость своего движения, а, наоборот, уменьшали ее, имеет смысл подобрать нелинейный, круто нарастающий ко дну пробирки градиент концентрации сахарозы. Так, чтобы совместное влияние роста плотности и особенно вязкости среды центрифугирования оказались сильнее, чем эффект увеличения радиуса вращения. Этого можно достигнуть, если диаметр смесителя сделать больше диаметра резервуара. При заполнении пробирки сумма объемов жидкости в обоих стаканах должна быть использована полностью. Сначала небольшие добавки плотной сахарозы из резервуара, разбавляясь в большом объеме жидкости в смесителе, будут лишь незначительно увеличивать начальную плотность раствора. Тем не менее, в конце заполнения пробирки плотность раствора в ней все равно достигнет максимального значения — градиент окажется медленно нарастающим в верхней части пробирки и крутым у ее дна.

Извлечение и определение разделившихся зон после окончания центрифугирования (поскольку они не окрашены) приходится делать «на ощупь». Проще всего, — так оно и делалось поначалу, — закрепив открытую пробирку в зажиме вертикально, проколоть ее дно иглой от шприца и собирать фракции по определенному числу капель в последовательный ряд пробирок, установленных в штативе, который самому экспериментатору и передвигать своевременно. Способ нехорош не только тупой трудоемкостью, но и изменением объема капель по мере опорожнения пробирки. Лучше к игле присоединить тонкую полиэтиленовую трубочку, а ее к перистальтическому насосу (будет описан в следующей главе) с заданной скоростью откачивания жидкости. От насоса подавать выбранное количество капель в пробирки, установленные в «коллектор фракции». Последний представляет из себя механический прибор, где порядка 100-150 пробирок поочередно, автоматически, — через заданные интервалы времени или после отсчета заданного числа капель, подводятся под капельницу, которой заканчивается трубочка, идущая от насоса.

Можно пробирку и не прокалывать, а иглу осторожно опустить сверху до дна пробирки и таким образом пофракционно отсасывать ее содержимое. В любом случае обнаружение разделенных зон осуществляется последовательной проверкой всех пробирок на ультрафиолетовое поглощение: на длине волны 280 тц для белков и 260 тц — для нуклеиновых кислот. Фракции, обнаружившие искомое содержимое, объединяются.

В качестве интересного для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, я выбрал исторические опыты Оказаки (1971 год), положившие основу современным представлениям о механизме редупликации ДНК. В этих опытах бактерии, растущие в жидкой питательной среде, получали через эту среду импульсную метку радиоактивным тимидином длительностью от 2 секунд до 2-х минут (в разных опытах). По окончании импульса бактерии быстро охлаждали, выделяли суммарную ДНК и центрифугировали ее в щелочном (для полной денатурации ДНК) градиенте 5-20% сахарозы в бакет-роторе на скорости 25 тыс. об/мин в течение 16 часов. После раскапывания градиента содержание новосинтезированной ДНК в каждой фракции оценивали по радиоактивности (в жидком сцинтилляторе — см. главу 15).

Далее происходит перераспределение метки между «свободными» (отделившимися в ходе выделения ДНК) фрагментами Оказаки и крупными фрагментами зрелой ДНК, лежащими в диапазоне 20—60 S. В эти последние преходит и часть радиоактивности, находившейся во фрагментах Оказаки, после их включения в состав комплементарной нити ДНК. Так что для кривых 5 и 6 относительная доля включения метки во фрагменты Оказаки и зрелую ДНК существенно изменяется.

Равновесное ультрацентрифугирование

Идея метода состоит в создании такого градиента по длине пробирки (в бакет-роторе), чтобы плотность среды центрифугирования у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска — меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.

Такое разделение имеет следующие особенности:

1. Размеры частиц и их массы не будут сказываться на окончательном распределении. Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.

2. Движение частиц к положению равновесия будет происходить как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом наряду с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.

3. Процесс центрифугирования должен быть весьма длительным, так как при подходе к положению равновесия частицы будут двигаться очень медленно.

4. Вязкость среды в связи с этим является нежелательным фактором.

5. При равновесном ультрацентрифугировании возможна заметно большая загрузка препаратом, чем при зонально-скоростном центрифугировании.

6. В области равновесия частицы расположатся в виде полосы, ширина которой определится соотношением двух процессов:

концентрирования за счет седиментации — флотации и тепловой диффузии частиц. Эта ширина будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды и чем больше масса частиц — увеличение массы уменьшает склонность к диффузии. Распределение концентрации вещества в полосе описывается симметричной (гауссовской) кривой. По ее ширине, зная координату центра полосы (Гд), угловую скорость вращения и крутизну градиента плотности среды в центре полосы (dp/dr) можно рассчитать массу (сольватиро-ванной) частицы.

Сахароза непригодна для создания градиента при равновесном центрифугировании. Как видно из таблицы, приведенной в предыдущем параграфе, плотность даже 30%-ного раствора сахарозы намного меньше, чем у основных биологических объектов, в то время, как вязкость уже возрастает «катастрофически».

Можно ожидать, что подходящей средой для равновесного центрифугирования будет концентрированный раствор соли какого-либо тяжелого металла. Плотность такого раствора может оказаться весьма значительной, в то время как вязкость солевого раствора слабо зависит от его концентрации. Как показал опыт, наиболее удобными средами для равновесного ультрацентрифугирования оказались концентрированные растворы хлористого или сернокислого цезия (CsCI). В нижеследующей таблице приведены значения плотности растворов CsCI различной весовой концентрации:

Рассматривая эту таблицу, полезно вспомнить зависимость плавучей плотности биологических молекул от присоединения воды и ионов. Там была указана величина плавучей плотности ДНК в концентрированном растворе CsCI — 1,7 г/см³ . таким образом различные по плотности молекулы ДНК, очевидно, можно фракционировать равновесным ультрацентрифугированием в градиенте CsCI. Чего нельзя сказать о РНК, плавучая плотность которой в этих условиях достигает величины >1,9 г/см³ . Белки же, напротив, успешно могут разделяться в описываемых условиях. Для них плавучая плотность в концентрированных растворах CsCI колеблется в пределах 1,3-1,33 г/см³ .

Литература

1 Давиденкова Е.Ф., Либерман И.С., Шафран М.Г. Генетические и патогенетические механизмы атеросклероза. // Клинич. медицина.-1990.- N 10.-С.-23.

2 Денисенко А.Д., Полесский В.А., Лозовский В.Т. Липопротеиды высокой плотности и атеросклероз. // Материалы I-го сов. - америк. симпозиума. - М.: Медицина, -1983.-С.113-122.

3 Дея К., Деккер М. Липопротеиды высокой плотности. - М.: Медицина,-1981.